ماليڪيولر تشخيص، عام طور تي استعمال ٿيل پي سي آر ٽيڪنالاجي ۽ اصول

پي سي آر، پوليميرس زنجير جو رد عمل آهي، جيڪو ڊي اين اي پوليمريز جي ڪيٽيليسس جي تحت سسٽم ۾ dNTP، Mg2+، ڊگھائي فيڪٽرز ۽ ايمپليفڪيشن وڌائڻ وارا عنصر شامل ڪرڻ جو حوالو ڏئي ٿو، پيرن ڊي اين اي کي ٽيمپليٽ ۽ مخصوص پرائمر استعمال ڪندي ايڪسٽينشن جي شروعاتي نقطي طور، Denaturation، annealing، extension، وغيره جي مرحلن ذريعي، ان ويٽرو ريپليڪٽنگ ڌيءَ اسٽرينڊ ڊي اين اي کي پورو ڪرڻ وارو عمل پيرين اسٽرينڊ ٽيمپليٽ ڊي اين اي کي جلدي ۽ خاص طور تي ڪنهن به ٽارگيٽ ڊي اين اي کي ويٽرو ۾ وڌائي سگھي ٿو.

1. گرم شروع PCR

روايتي پي سي آر ۾ ايمپليفڪيشن جي شروعات جو وقت پي سي آر مشين کي پي سي آر مشين ۾ نه رکڻ آهي، ۽ پوء پروگرام کي وڌائڻ شروع ٿئي ٿو.جڏهن سسٽم جي ٺاھ جوڙ مڪمل ٿئي ٿي، ايمپليفڪيشن شروع ٿئي ٿي، جيڪا غير مخصوص ايمپليفڪيشن سبب ٿي سگھي ٿي، ۽ گرم شروع ٿيندڙ PCR ھن مسئلي کي حل ڪري سگھي ٿو.

گرم شروع PCR ڇا آهي؟رد عمل جي سسٽم جي تيار ٿيڻ کان پوء، اينزيم موڊيفائر کي تيز گرمي پد (عام طور تي 90 ° C کان وڌيڪ) تي رد عمل جي شروعاتي حرارتي اسٽيج يا "گرم شروع" اسٽيج دوران جاري ڪيو ويندو آهي، انهي ڪري ته ڊي اين اي پوليمريز کي چالو ڪيو وڃي.صحيح چالو ٿيڻ جو وقت ۽ گرمي پد DNA پوليميرس جي فطرت ۽ گرم شروع ڪرڻ واري تبديليءَ تي منحصر آهي.اهو طريقو خاص طور تي ڊي اين اي پوليميرس جي سرگرمي کي روڪڻ لاءِ ترميم ڪندڙ جهڙوڪ اينٽي باڊيز، لاڳاپن واري ليگينڊس، يا ڪيميائي ترميمن کي استعمال ڪندو آهي.جيئن ته ڊي اين اي پوليميرس جي سرگرمي کي ڪمري جي حرارت تي روڪيو وڃي ٿو، گرم شروع ڪرڻ واري ٽيڪنالاجي پي سي آر جي رد عمل جي خاصيت کي قربان ڪرڻ کان سواء ڪمري جي حرارت تي ڪيترن ئي پي سي آر ردعمل سسٽم تيار ڪرڻ لاء وڏي سهولت فراهم ڪري ٿي.

2. RT-PCR

RT-PCR (ريورس ٽرانسڪرپشن پي سي آر) هڪ تجرباتي ٽيڪنڪ آهي ريورس ٽرانسڪرپشن لاءِ mRNA کان cDNA ۾ ۽ ان کي استعمال ڪرڻ لاءِ ٽيمپليٽ جي طور تي.تجرباتي طريقو اهو آهي ته ٽشوز يا سيلز ۾ ڪل RNA پهريون ڀيرو ڪڍيو وڃي، اولگو (dT) کي پرائمر طور استعمال ڪيو وڃي، cDNA کي ٺهڪائڻ لاءِ ريورس ٽرانسڪرپٽ استعمال ڪيو وڃي، ۽ پوءِ ٽارگيٽ جين حاصل ڪرڻ يا جين جي اظهار کي ڳولڻ لاءِ پي سي آر ايمپليفڪيشن لاءِ ٽيمپليٽ طور cDNA استعمال ڪيو وڃي.

3. فلورسنٽ مقداري پي سي آر

فلورسنٽ مقداري پي سي آر (حقيقي وقت جي مقداري پي سي آر،RT-qPCR) PCR رد عمل سسٽم ۾ فلورسنٽ گروپن کي شامل ڪرڻ جو طريقو، حقيقي وقت ۾ پوري PCR عمل جي نگراني ڪرڻ لاء فلورسنٽ سگنلن جي جمع کي استعمال ڪندي، ۽ آخرڪار معياري وکر استعمال ڪندي ٽيمپليٽ کي مقداري طور تي تجزيو ڪرڻ لاء.عام طور تي استعمال ٿيل qPCR طريقن ۾ شامل آهن SYBR Green I ۽ TaqMan.

4. Nested PCR

Nested PCR PCR پرائمر جي ٻن سيٽن جي استعمال ڏانهن اشارو ڪري ٿو PCR amplification جي ٻن دورن لاءِ، ۽ ٻئي دور جي ايمپليفڪيشن پراڊڪٽ ٽارگيٽ جين ٽڪرا آهي.

جيڪڏهن پرائمر جي پهرين جوڙي (ٻاهرئين پرائمر) جي بي ميلاپ سبب هڪ غير مخصوص پراڊڪٽ کي وڌايو وڃي ٿو، ساڳئي غير مخصوص علائقي جي پرائمر جي ٻئي جوڙي جي سڃاڻپ ٿيڻ جو امڪان تمام ننڍڙو آهي، تنهنڪري پرائمر جي ٻئين جوڙ پاران وڌائڻ، پي سي آر جي خاصيت کي بهتر ڪيو ويو آهي.PCR جي ٻن رائونڊ کي انجام ڏيڻ جو هڪ فائدو اهو آهي ته اهو محدود شروعاتي ڊي اين اي مان ڪافي پيداوار کي وڌائڻ ۾ مدد ڪري ٿو.

5. ٽچ ڊائون پي سي آر

ٽچ ڊائون پي سي آر ھڪڙو طريقو آھي پي سي آر جي رد عمل جي خصوصيت کي بهتر ڪرڻ لاءِ پي سي آر سائيڪل جي پيرا ميٽرز کي ترتيب ڏيڻ سان.

ٽچ ڊائون پي سي آر ۾، پهرين چند چڪر لاء اينيلنگ جي درجه حرارت مقرر ڪئي وئي آهي چند درجا مٿي پرائمر جي وڌ ۾ وڌ اينيلنگ درجه حرارت (Tm) کان.اعلي اينيلنگ درجه حرارت غير مخصوص ايمپليفڪيشن کي مؤثر طور تي گھٽائي سگھي ٿو، پر ساڳئي وقت، اعلي اينيلنگ درجه حرارت پرائمر ۽ ٽارگيٽ جي ترتيب جي جدائي کي وڌائيندو، نتيجي ۾ پي سي آر جي پيداوار گھٽجي ويندي.تنهن ڪري، پهرين چند چڪرن ۾، سسٽم ۾ ٽارگيٽ جين جي مواد کي وڌائڻ لاء انيلنگ جي درجه حرارت عام طور تي 1 ° C في چڪر جي گھٽتائي لاء مقرر ڪئي وئي آهي.جڏهن annealing جي گرمي پد کي گهٽجي وڃي ته وڌ ۾ وڌ گرمي پد، annealing گرمي پد باقي چڪر لاء برقرار رکيو ويندو آهي.

6. سڌو PCR

سڌو پي سي آر سڌو سنئون نموني مان ٽارگيٽ ڊي اين اي جي واڌاري ڏانهن اشارو ڪري ٿو بغير نيوڪليڪ ايسڊ جي الڳ ڪرڻ ۽ صاف ڪرڻ جي ضرورت کان سواء.

سڌو PCR جا ٻه قسم آهن:

سڌو طريقو: نموني جي هڪ ننڍڙي رقم وٺو ۽ ان کي سڌو سنئون پي سي آر ماسٽر ميڪس ۾ شامل ڪريو پي سي آر جي سڃاڻپ لاء؛

ٽوڙڻ جو طريقو: نموني کي نموني ڏيڻ کان پوء، ان کي lysate ۾ شامل ڪريو، جينوم کي ڇڏڻ لاء lyse، lysed supernatant جي ٿوري مقدار وٺو ۽ ان کي PCR Master Mix ۾ شامل ڪريو، PCR جي سڃاڻپ ڪريو.اهو طريقو تجرباتي ڪم جي فلو کي آسان بڻائي ٿو، هٿ تي وقت گھٽائي ٿو، ۽ صفائي جي مرحلن دوران ڊي اين اي نقصان کان بچي ٿو.

7. SOE PCR

اوورليپ ايڪسٽينشن پي سي آر (SOE PCR) ذريعي جين ورهائڻ، پي سي آر پروڊڪٽس کي اوورليپنگ زنجيرن ٺاهڻ لاءِ مڪمل سرن سان پرائمر استعمال ڪري ٿو، ته جيئن اڳتي هلي ايمپليفڪيشن جي رد عمل ۾، اوورليپنگ زنجيرن جي توسيع جي ذريعي، مختلف ذريعن جي هڪ ٽيڪنڪ جنهن ۾ وڌايل ٽڪرا اوورليپ ٿين ٿا. ۽ گڏجي ورهايو ويو.هن ٽيڪنالاجي ۾ هن وقت ٻه مکيه ايپليڪيشن هدايتون آهن: فيوزن جين جي تعمير؛جين سائيٽ جي هدايت واري ميوٽيشن.

8. IPCR

Inverse PCR (IPCR) ٻن پرائمر کان سواءِ ڊي اين اي جي ٽڪڙن کي وڌائڻ لاءِ ريورس ڪمپليمينٽري پرائمر استعمال ڪري ٿو، ۽ نامعلوم ڊي اين اي فريگمينٽ جي ٻنهي پاسن تي اڻڄاتل تسلسل کي وڌائي ٿو.

IPCR اصل ۾ ويجھي اڻڄاتل علائقن جي تسلسل کي طئي ڪرڻ لاءِ ٺهيل هئي، ۽ گهڻو ڪري استعمال ڪيو ويندو آهي جين پروموٽر جي ترتيبن جو مطالعو ڪرڻ لاءِ؛oncogenic chromosomal rearrangements، جيئن جين فيوزن، translocation ۽ transposition؛۽ وائرل جين انضمام، پڻ عام طور تي استعمال ڪيا ويا آهن سائيٽ جي هدايت واري ميوٽيجنيسس لاء، گهربل ميوٽيشن سان گڏ هڪ پلازميڊ کي نقل ڪريو.

9. ڊي پي سي آر

ڊجيٽل پي سي آر (ڊي پي سي آر) نيوڪليڪ ايسڊ ماليڪيولز جي مطلق مقدار جي لاءِ هڪ ٽيڪنڪ آهي.

في الحال ٽي طريقا آهن نيوڪليڪ ايسڊ ماليڪيولز جي مقدار کي طئي ڪرڻ لاءِ.فوٽوميٽري نيوڪليڪ ايسڊ ماليڪيولز جي جذب تي ٻڌل آهي.ريئل ٽائيم فلورسنٽ مقداري پي سي آر (ريئل ٽائيم پي سي آر) Ct قدر تي مبني آهي، ۽ Ct قدر ان چڪر نمبر ڏانهن اشارو ڪري ٿو جيڪو فلورسنس قدر سان لاڳاپيل آهي جنهن کي ڳولي سگهجي ٿو؛ڊجيٽل پي سي آر جديد مقداري ٽيڪنالاجي آهي جنهن تي ٻڌل واحد ماليڪيول پي سي آر طريقي تي ڳڻڻ لاءِ نيوڪلڪ ايسڊ جي مقدار جي ڳڻپ هڪ مطلق مقداري طريقو آهي.