الٽرا فلٽريشن سينٽرفيوج ٽيوب جو استعمال ۽ احتياط
1) هڪ مناسب ultrafiltration ٽيوب چونڊيو.نوٽ ڪريو ته UF جھلي مختلف ڪيميائي جي رواداري جي سطح ۾ مختلف آھن.عام طور تي، 10 kDa ماليڪيولر ويٽ ڪٽ-آف سان الٽرا فلٽريشن ٽيوبز کي ماليڪيولر ويٽ ڪٽ آف سان چونڊيو وڃي ٿو جيڪو دلچسپي جي پروٽين جي ماليڪيولر وزن جي 1/3 کان وڌيڪ نه هجڻ گهرجي، جهڙوڪ 35 kDa.جيڪڏهن دلچسپي جي پروٽين جو ماليڪيولر وزن 10 kd جي لڳ ڀڳ آهي، 3 KD جي ماليڪيولر وزن ڪٽ آف سان هڪ الٽرا فلٽريشن ٽيوب استعمال ڪري سگهجي ٿو.
(2) الٽرا فلٽريشن، تازو خريد ڪيو ويو، خشڪ آهي، استعمال ڪرڻ کان اڳ الٽرا پيور پاڻي شامل ڪيو وڃي ٿو ۽ پاڻي مڪمل طور تي جھلي، برف جي غسل يا فرج مان گذري ٿو جيڪو ڪجھ منٽن لاء اڳ کان ٿڌو آهي.ان کان پوء پاڻي بند ڪيو ويندو آهي، يعني پروٽين جي مائع، ۽ ڪيترو شامل ڪيو ويندو آهي، جيڪو ٽيوب جي چوٽي تي سفيد لائن کان وڌيڪ نه آهي.آپريشن هلڪو آهي، ۽ پروٽين جي حل کي شامل ڪرڻ کان اڳ الٽرا فلٽريشن ٽيوب کي برف تي کولڻ جي ضرورت آهي.
3) ٻنهي ماس ۽ ڪشش ثقل جو مرڪز توازن تائين پهچڻو هو.نوٽ ڪريو گھمڻ واري رفتار ۽ تيز رفتار تمام تيز نه آھن، ٻي صورت ۾ الٽرا فلٽريشن جھلي کي سڌو نقصان پھچائي ٿو.Centrifugal ultrafiltration شروع ڪيو ويو (centrifuge precooled to 4 درجا).مختلف centrifuges جي RPM کان پوء g ۾ تبديل ڪيو ويو، اهو مختلف هو.سينٽرفيوج جي تيز رفتار کي گھٽ ۾ گھٽ وڌايو ويو، جھلي تي دٻاء کي گھٽائڻ.نوٽ، سينٽرفيوج کي ڇڏڻ جي پڪ ڪريو ته سينٽرفيوج پنهنجي منزل جي رفتار تي پهچي چڪو آهي، يا جيڪڏهن توهان کي ڪو مسئلو آهي، ته توهان ان کي پهريون ڀيرو سنڀالي نه ٿا سگهو.اسپنڊل ڏانهن جھلي جي رخ کي هدايتن جي مطابق ترتيب ڏنو ويو (ڪواني سينٽرريفيوج ڪيس جھلي کي محور تي عمودي آھي).عملي استعمال ۾، عام گردش جي رفتار هدايتن جي ڀيٽ ۾ گهٽ آهي، تنهنڪري سينٽرفيوج ٽيوب جي زندگي وڌائي سگهجي ٿي.
3) ٻنهي ماس ۽ ڪشش ثقل جو مرڪز توازن تائين پهچڻو هو.نوٽ ڪريو گھمڻ واري رفتار ۽ تيز رفتار تمام تيز نه آھن، ٻي صورت ۾ الٽرا فلٽريشن جھلي کي سڌو نقصان پھچائي ٿو.Centrifugal ultrafiltration شروع ڪيو ويو (centrifuge precooled to 4 درجا).مختلف centrifuges جي RPM کان پوء g ۾ تبديل ڪيو ويو، اهو مختلف هو.سينٽرفيوج جي تيز رفتار کي گھٽ ۾ گھٽ وڌايو ويو، جھلي تي دٻاء کي گھٽائڻ.نوٽ، سينٽرفيوج کي ڇڏڻ جي پڪ ڪريو ته سينٽرفيوج پنهنجي منزل جي رفتار تي پهچي چڪو آهي، يا جيڪڏهن توهان کي ڪو مسئلو آهي، ته توهان ان کي پهريون ڀيرو سنڀالي نه ٿا سگهو.اسپنڊل ڏانهن جھلي جي رخ کي هدايتن جي مطابق ترتيب ڏنو ويو (ڪواني سينٽرريفيوج ڪيس جھلي کي محور تي عمودي آھي).عملي استعمال ۾، عام گردش جي رفتار هدايتن جي ڀيٽ ۾ گهٽ آهي، تنهنڪري سينٽرفيوج ٽيوب جي زندگي وڌائي سگهجي ٿي.
(4) جڏهن باقي 1ml تي مرڪوز ڪيو وڃي، 50ul بفر جو حل وٺو، 10ul جو وهڪرو شامل ڪريو ۽ ڏسو ته ڇا ڪو نيرو رنگ آهي، اهو فيصلو ڪيو ته الٽرا فلٽريشن ٽيوب ۾ پروٽين موجود ناهي.جيڪڏهن ٽيوب ليڪي آهي، ته مٿئين پرت کي ٻيهر وجھو ۽ الٽرا فلٽريشن شروع ڪرڻ لاءِ نئين ٽيوب ۾ وهايو.صحيح طور تي معلوم ڪرڻ لاءِ ته ڇا ٽيوبون مس ٿي ويون آهن، 10 منٽن لاءِ سينٽرفيوج کي 5mgml BSA سان گڏ فلو تھرو کان اڳ، پروٽين گلو تي هلندڙ، يا برادفورڊ کروڊ ايسي، ۽ باقي مرڪوز پروٽين جي محلول کي شامل ڪندي جاري رکو (جيڪو برف تي هلندو آهي ۽ پروٽين کي گرم ٿيڻ کان روڪي ٿو) سمورو ڌيان شامل ڪيو ويو آهي.سينٽرفيوگريشن دوران احتياط ڪريو جيڪڏهن پروٽينن جي ورهاڱي ٿئي ٿي، جنهن جي ڪري ٽيوب بند ٿي وڃي ٿي.جيڪڏهن ورن ٿئي ٿي، اهو طئي ڪيو ته ڇا ورڻ جو خاص سبب پروٽينن جو گهڻو مقدار آهي يا هڪ نامناسب بفر؛اڳئين کي حل ڪري سگهجي ٿو الٽرا فلٽريشن ذريعي ڪيترن ئي الٽرا فلٽريشن ٽيوبن جي هڪ ئي وقت، ڪنسنٽريشن کي گهٽائي، ۽ بعد ۾ مختلف بفر حلن جي مٽا سٽا ڪري جيستائين پروٽين جو ورهاڱو نه ٿئي.
(4) جڏهن باقي 1ml تي مرڪوز ڪيو وڃي، 50ul بفر جو حل وٺو، 10ul جو وهڪرو شامل ڪريو ۽ ڏسو ته ڇا ڪو نيرو رنگ آهي، اهو فيصلو ڪيو ته الٽرا فلٽريشن ٽيوب ۾ پروٽين موجود ناهي.جيڪڏهن ٽيوب ليڪي آهي، ته مٿئين پرت کي ٻيهر وجھو ۽ الٽرا فلٽريشن شروع ڪرڻ لاءِ نئين ٽيوب ۾ وهايو.صحيح طور تي معلوم ڪرڻ لاءِ ته ڇا ٽيوبون گم ٿي ويون آهن، 10 منٽن لاءِ سينٽرفيوج کي 5mgml BSA سان گڏ فلو تھرو کان اڳ، پروٽين جي گلو تي هلندي، يا برادفورڊ کروڊ ايسي، ۽ باقي رهيل پروٽين جي حل کي شامل ڪندي جاري رکو (جيڪو برف تي هلندو آهي ۽ پروٽين کي گرم ٿيڻ کان روڪي ٿو) سمورو ڌيان شامل ڪيو ويو آهي.سينٽرفيوگريشن دوران احتياط ڪريو جيڪڏهن پروٽينن جي ورهاڱي ٿئي ٿي، جنهن جي ڪري ٽيوب بند ٿي وڃي ٿي.جيڪڏهن برسات ٿئي ٿي، اهو طئي ڪيو ته ڇا ورڻ جو خاص سبب پروٽينن جو گهڻو مقدار آهي يا هڪ نامناسب بفر؛اڳئين کي حل ڪري سگهجي ٿو الٽرا فلٽريشن ذريعي ڪيترن ئي الٽرا فلٽريشن ٽيوبن جي هڪ ئي وقت، ڪنسنٽريشن کي گهٽائي، ۽ بعد ۾ مختلف بفر حلن جي مٽا سٽا ڪري جيستائين پروٽين جو ورهاڱو نه ٿئي.
(5) پروٽين کي مرڪوز ڪرڻ لاءِ پهريان ڪجھ مرحلا استعمال ڪيا وڃن ٿا، ۽ جيڪڏهن بفر کي تبديل ڪرڻو آهي، ته نرميءَ سان نئون بفر (0.22um الٽرا فلٽريشن ميمبرين ذريعي الٽرا فلٽريشن) ڪل پروٽين جي اٽڪل 1ml تي شامل ڪريو، ۽ ٽن لاءِ اٽڪل 1ml تي ٻيهر ڪنسٽرٽ ڪريو. لڳاتار وقت، آخري مرڪوز حتمي حجم سان مطلوب پروٽين جي ڪنسنٽريشن تي منحصر آهي، عام طور تي 500ul کان وڌيڪ نه، پر 200ul جي اندر پڻ.حاصل ڪريو 1000 × يا ان کان وڌيڪ ٽن موقعن تي، بنيادي طور تي جيترو بفر تبديلي، گھٽ ۾ گھٽ 10 × يا ان کان وڌيڪ حجم جي هر ڀيري جي حساب سان.
(5) پروٽين کي مرڪوز ڪرڻ لاءِ پهريان ڪجھ مرحلا استعمال ڪيا وڃن ٿا، ۽ جيڪڏهن بفر کي تبديل ڪرڻو آهي، ته نرميءَ سان نئون بفر شامل ڪريو (الٽرا فلٽريشن ذريعي 0.22um الٽرا فلٽريشن ميمبرين) ڪل پروٽين جي اٽڪل 1ml تي، ۽ ٽن لاءِ اٽڪل 1ml تي ٻيهر ڪنسٽرٽ ڪريو. لڳاتار وقت، آخري مرڪوز حتمي حجم سان مطلوب پروٽين جي ڪنسنٽريشن تي منحصر آهي، عام طور تي 500ul کان وڌيڪ نه، پر 200ul جي اندر پڻ.حاصل ڪريو 1000 × يا وڌيڪ ٽن موقعن تي، بنيادي طور تي جيترو بفر تبديلي، گھٽ ۾ گھٽ 10 × يا ان کان وڌيڪ حجم جي هر ڀيري جي حساب سان.
پوسٽ ٽائيم: نومبر-09-2022